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生化試劑應(yīng)用常見問題的探討

更新時間:2011-03-18  |  點擊率:2012
試劑空白吸光度是反映試劑質(zhì)量的指標(biāo)之一,但不能反映試劑質(zhì)量的全部。試劑成份、純度、用量及穩(wěn)定性,才是保證試劑質(zhì)量的關(guān)鍵所在。目前市售的一些試劑具有抗干擾作用,主要是通過加入抗干擾物質(zhì)或使用新的色素原以避免內(nèi)源性物質(zhì)的干擾。但值得注意的是:一些試驗項目在消除內(nèi)源性物質(zhì)干擾的同時,會帶來樣品含量真實性的變化。
1 試劑空白
試劑空白吸光度是反映試劑質(zhì)量的指標(biāo)之一。每種試劑都有一定的空白吸光度范圍,試劑空白吸光度的改變往往提示該試劑的變質(zhì);如利用Trinder反應(yīng)為原理的檢測試劑會因含酚類物質(zhì)被氧化為醌而變?yōu)榧t色。堿性磷酸酶、r一谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶、淀粉酶等檢測試劑會因基質(zhì)分解出硝基酚或酚基苯胺而變黃。有些試劑久置后變渾濁。這些情況均可使空白吸光度升高。丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶等負反應(yīng),在放置過程中其試劑空白吸光度會因NADH自行氧化為NAD+而下降。原則上,吸光度上升的反應(yīng),其試劑空白吸光度越低越好,不能超過一個高限;相反,吸光度下降的反應(yīng),其試劑空白吸光度不能低于一個低限。因此,試劑空白吸光度限值,常作為程序參數(shù)輸入儀器,如經(jīng)核查超限,儀器會自動報警,提示更換試劑。需要指出的是,還原型輔酶I(或II)等投料量不足或劣質(zhì)的原料,往往需要加大用量,才使“表觀”吸光度上升,湊合過試劑空白核對的“關(guān)”,其后果為如下情況:
1.1 線性范圍變窄 現(xiàn)象:高值測不高。原因:生產(chǎn)試劑時有效成分投料量不足;試劑成份穩(wěn)定性較差。
1.2 靈敏度變低現(xiàn)象:酶促反應(yīng)速度曲線斜率下降,測定結(jié)果有嚴(yán)重系統(tǒng)誤差。原因:試劑底物濃度不足。
1.3 低值偏高 現(xiàn)象:試劑空白的變化曲線(吸光度VS時間)明顯波動。原因:試劑自身不穩(wěn)定,自行分解;工具酶純度
不夠,雜酶含量超限,導(dǎo)致干擾作用。
2 樣品信息
樣品的溶血、脂血、黃疸等會對測定結(jié)果產(chǎn)生非化學(xué)反應(yīng)的干擾。因此,應(yīng)根據(jù)溶血、脂濁、黃疸的光譜吸收特性,采用雙波長或多波長的檢測模式,并在結(jié)果計算中扣除因溶血、脂血、黃疸引起的影響,減少干擾程度。
3 測定范圍
每種待測物都有一個可測定的濃度或活性范圍,樣品結(jié)果若超過此范圍,分析儀將顯示結(jié)果超過范圍的提示。表示試劑已經(jīng)變質(zhì),應(yīng)更換合格試劑。
4 底物耗盡
使用連續(xù)監(jiān)測法、兩點法測定酶活性時,若酶活性非常高,底物接近被耗盡,吸光度上升或下降會超過某一吸光度變化范圍,監(jiān)測期的吸光度將偏離線性,使測定結(jié)果不可靠。
5 酶的預(yù)活化
測定血清中的某些酶,如CK,離體(采血)后很容易失活。失活的原因是酶活性中心的活性基因巰基(一SH)被氧化造成的。只有通過適當(dāng)?shù)倪€原作用才能重新激活。如CK—NAC試劑盒即含有CK活化劑,名為N一乙酰半胱氨酸。實驗研究證明,NAC對血清中已失活的CK活化過程約需180 S。這就是CK測定為什么要延遲時間較長的理論依據(jù)。在AST,ALT采用IFCC推薦方法測定時需要磷酸吡哆醛預(yù)活化。需要強調(diào):含有活化劑的生化試劑,其測定酶活性的結(jié)果要高些。
6 校準(zhǔn)與結(jié)果溯源性
酶的校正:要滿足在同一方法學(xué)、同一測定條件、與理論計算的FACTOR值差異不大,沒有發(fā)現(xiàn)有明顯影響因素,方可
進行校正。
檢驗結(jié)果溯源性,得建立一個可靠的參考系統(tǒng)作為準(zhǔn)確性基礎(chǔ),然后將準(zhǔn)確性轉(zhuǎn)移到常規(guī)方法測定中去,使常規(guī)方法測定結(jié)果可溯源到參考系統(tǒng)所提供的準(zhǔn)確性基礎(chǔ)上來。在實現(xiàn)溯源性目標(biāo)過程中,永遠以患者新鮮標(biāo)本為實驗對象,以方法學(xué)對比試驗方法為驗證手段。方法學(xué)對比試驗常采用回歸方程進行統(tǒng)計分析,假如斜率接近1,截距較小,這意味著實驗室常規(guī)方法對標(biāo)本測定結(jié)果和溯源目標(biāo)參考系統(tǒng)對標(biāo)本檢測結(jié)果非常接近。
臨床化學(xué)中參考標(biāo)準(zhǔn)(二級標(biāo)準(zhǔn))要有通用性,但生產(chǎn)廠家提供的校準(zhǔn)液并非通用的,只適用于某一特定的分析系統(tǒng)。
校準(zhǔn)液標(biāo)示值往往是按其基質(zhì)偏差修正的,所以標(biāo)示值并非實際值。校準(zhǔn)液、質(zhì)控血清通常是經(jīng)過處理的混合人或動物血清,這種制備物在特定分析系統(tǒng)中往往與人新鮮血清反應(yīng)性不同而產(chǎn)生基質(zhì)偏差。如總膽固醇測定基質(zhì)效應(yīng)研究指出:校準(zhǔn)液酶法測定回收結(jié)果偏低可達5%~7%。
7 試劑抗干擾作用的合理性有些液體雙試劑,其實質(zhì)并不真正具備抗干擾的能力而只是解決了試劑的液體化和穩(wěn)定性問題。如,ALT試劑盒中,NADH在pH7.5~7.8水溶液中極不穩(wěn)定,在pH>8.7時才能穩(wěn)定保存。因此,為了保證試劑穩(wěn)定性,液體雙試劑的R1需要維持pH>8.7,但此時LDH活性大大下降,就失去消除內(nèi)源性丙酮酸的功能,只有加入試劑R2后,反應(yīng)混合液的pH下降至LDHzui適pH,在經(jīng)過延遲時間60 S后,才能消除內(nèi)源性丙酮酸的干擾。再如,Tfinder反應(yīng)中抗Vc干擾問題:由于維生素c易氧化,樣品中Vc會競爭反應(yīng)生成的過氧化氫,而產(chǎn)生負干擾。因此,在試劑R1中加入抗壞血酸氧化酶,這種方法是有效的,但不一定有很大的意義。因為Vc干擾必須同時具備二個條件:a)Vc攝入量較多;b)采血后立即測定。實驗表明離體血清中Vc在90 min后會全部被氧化。又如,使用胺類新色原。a)分子共軛結(jié)構(gòu)特性使得靈敏度提高,相應(yīng)可以減少樣本用量,zui終能有效地降低干擾物的量.b)使生成胺類色素原zui大吸收峰由500~520 nm移至550 nm以上,以避開黃疸、溶血干擾。如:亞鐵氰化鉀一H 0 ,能有效避免黃疸干擾的理論依據(jù)是亞鐵氰化鉀與H。0。親和力遠遠大于膽紅素。
甘油三酯測定,有人主張選用雙試劑方法消除內(nèi)源性甘油,這個方法是可行的,但忽視了一個化學(xué)平衡理論。因為所有的酯在水溶液中都不是簡單地以酯的形式存在,而是以水解與酯化相平衡的形式存在。在一個平衡體系中,如果去除游離甘油,這個平衡就向生成甘油方向移動,甘油三酯就會重新水解,生成新的甘油,達到新的平衡,因此樣品與R1試劑孵育時間越長,測得甘油三酯值就越低。甘油三酯測定,不僅要去除游離甘油,而且還要克服樣本含量真實性發(fā)生的變化,試劑中必須加入甘油激酶,并且延遲時間要標(biāo)準(zhǔn)化。所以,一些試驗項目在消除內(nèi)源性物質(zhì)干擾的同時,會帶來樣品含量真實性的變化。
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