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葡聚糖凝膠過(guò)柱的經(jīng)驗(yàn)

更新時(shí)間:2011-03-03  |  點(diǎn)擊率:2973

1、Sephadex LH-20的步驟。
(1) 選擇條件:
梯度洗脫在Sephadex使用中并不象在正相柱層析中那么重要。首先你的樣品須要能溶解在盡量少量的洗脫劑中。極性在的用甲醇水系統(tǒng);極性小者一般用不含水的系統(tǒng)。我們實(shí)驗(yàn)室常用正己烷二氯甲烷甲醇系統(tǒng),用了很多年,效果較好。
(2) 飽和層析柱:
用洗脫劑將凝膠搖勻,直立柱身,讓其自然沉降,此時(shí)要防止氣泡留在其中。至少半小時(shí)打開(kāi)開(kāi)關(guān),流出幾個(gè)柱體種的洗脫劑,目的是使其膨脹在正確比例的洗脫劑中。
(3) 樣品處理:用盡量少的洗脫劑溶解樣品,常壓過(guò)濾。
(4) 濕法上柱。這也是要有技巧的步驟。
(5) 洗脫:控制流速,一般1drop/s以下,可參見(jiàn)廠家的一些參數(shù);必要時(shí)更改極性(很多時(shí)一個(gè)極性就可以將樣品洗脫完畢)。
再生以備下次使用。
 
2 Sephadex LH20 的原理。
Sephadex LH20的分離原理主要有兩方面:以凝膠過(guò)濾作用為主,兼具反相分配的作用(在反相溶劑中)。因?yàn)槟z過(guò)濾作用,所以大分子的化合物保留弱,先被洗脫下來(lái),小分子的化合物保留強(qiáng),zui后出柱。如果使用反相溶劑洗脫, Sephadex LH20對(duì)化合物還起反相分配的作用,所以極性大的化合物保留弱,先被洗脫下來(lái),極性小的化合物保留強(qiáng),后出柱。如果使用正相溶劑洗脫,這主要靠凝膠過(guò)濾作用來(lái)分離。
 3 Sephadex LH20 洗脫溶劑。
看完第2點(diǎn)后,就應(yīng)該清楚Sephadex LH20 洗脫溶劑因分為兩類(lèi):反相和正相兩種。用得zui多的是反相溶劑洗脫,以甲醇--水系統(tǒng)zui為常見(jiàn),先用水,逐漸增加甲醇比例,zui后用100%甲醇沖柱。正相系統(tǒng)以氯仿--甲醇zui為常見(jiàn),先用50%氯仿--甲醇,逐漸增加甲醇比例,zui后用100%甲醇沖柱。
 
  4 Sephadex LH20 樣品的處理和洗脫溶劑的選擇。
如果樣品極性大,這選用反相溶劑洗脫(甲醇--水),樣品用zui少體積的甲醇--水(盡可能甲醇少一些)溶解,過(guò)濾后,濕法上樣(一定要濾喔!要是把Sephadex LH20 堵啦,就得將Sephadex LH20 的柱頭部分棄去,很心痛呀)。如果樣品極性小,這選用正相溶劑洗脫(氯仿--甲醇),樣品用zui少體積的氯仿--甲醇溶解,過(guò)濾后,濕法上樣。
1 Sephadex G型
葡聚糖凝膠只適合在水中使用,Sephadex G-25羥丙化后就是Sephadex LH-20。其既有分子篩作用,在由極性與非極性溶劑組成的溶劑中還有反相層析效果。雖然價(jià)位很高,但由于性能頗佳,可再生利用,所以倍受親睞。此外上柱樣品損失很少,對(duì)處理小樣品較好,這也是我們實(shí)驗(yàn)室常用的原因之一。
 6 分離的技巧,zui后說(shuō)說(shuō)我的使用心得
(1) 流速不可太快,切切不可新急,所謂欲速則不達(dá)。
(2)柱子盡可能長(zhǎng), Sephadex LH20 柱長(zhǎng)的增加將極大地改善分離,所不要吝惜填料,寧可將填料全裝在一根大柱子中,不要將填料裝成幾根小柱。所謂集中優(yōu)勢(shì)兵力,打擊敵人。
(3) 餾分一定要接的細(xì),可1/10,或1/20 個(gè)保留體積接成一餾分。
(4) 洗脫體積一般為2-3個(gè)保留體積,對(duì)特殊保留強(qiáng)的化合物,可洗脫5個(gè)保留體積。
(5)鞣質(zhì)成分死吸附嚴(yán)重,如不在乎填料者,可用Sephadex LH20 分鞣質(zhì)
(6)Sephadex LH20 對(duì)黃酮類(lèi)成分的分離效果,方法很成型,有大量文獻(xiàn)參考。
(7)填料反復(fù)使用,每次用完,一般可用甲醇將柱子洗干凈,然后用下一次分離的起步溶劑將甲醇替換出來(lái),待用。

   Sephadex LH-20是由葡聚糖G-25羥丙基化加工而成,屬于分子篩凝膠,尤其適用于天然產(chǎn)物在有機(jī)溶劑中的純化。例如:類(lèi)固醇、萜類(lèi)、脂類(lèi)以及小分子多肽等,Pharmadex LH-20同時(shí)適用于分子類(lèi)別非常相似的物質(zhì)的分離和工業(yè)規(guī)模的制備,既可用于初步純化步驟,也可用于zui終精制步驟,如非對(duì)映同分異構(gòu)體的分離。
   1.裝柱
裝填的重要原則之一就是需要形成一個(gè)穩(wěn)定均一的柱床。膠顆粒越均一(粒徑分布越窄),越容易獲得穩(wěn)定均一的柱床。但是對(duì)于Sephadex LH-20而言,25~100μm的粒徑范圍相對(duì)于許多用于制備色譜的填料而言,不能說(shuō)分布均一,也就是說(shuō)其粒徑分布較寬。然而當(dāng)膠溶脹后就相對(duì)容易得到均一的柱床。這對(duì)于長(zhǎng)柱(zui高至250cm)而言也是同樣的。在裝柱前,層析柱和儲(chǔ)槽都必須進(jìn)行*的清洗。
Sephadex LH-20在使用之前必須進(jìn)行溶脹。在溶脹的過(guò)程中,要盡量避免過(guò)分?jǐn)嚢?,否則會(huì)破壞球形膠粒,且要避免使用磁力攪拌器。
在室溫下,將凝膠溶脹于層析溶劑中至少三小時(shí),溶脹后膠體積的大小決定于所使用的溶劑系統(tǒng),請(qǐng)參考后頁(yè)之干膠溶脹表計(jì)算特定柱體積所需要干膠的量。使溶脹膠體積沉淀之后占總體積的75%,上層溶劑占25%,這時(shí),懸浮液從一個(gè)容器倒入另一容器時(shí)膠??梢苿?dòng)。將溶脹后的凝膠根據(jù)裝柱要求均勻倒入柱內(nèi),在保證膠粒不變形的前提下,應(yīng)在盡可能高的壓力下裝柱,反壓不要超過(guò)1.5ba。
    2.平衡
上樣前,用洗脫液平衡層析柱至少兩個(gè)柱體積直到基線變得平穩(wěn)為止,如改變?nèi)軇?yīng)該注意凝膠在新溶劑中的溶脹性質(zhì),并根據(jù)性質(zhì)確定柱高調(diào)節(jié)器的位置,如使用相同的溶劑,在以后的層析中柱平衡可以省略。
    3.洗脫液
為確保延長(zhǎng)層析柱的使用壽命,所有的緩沖液都應(yīng)該離心或經(jīng)過(guò)0.45um的膜過(guò)濾以除去雜質(zhì)。
    4.樣品
樣品體積應(yīng)該占柱總體積的1-2%,同樣在使用之前樣品應(yīng)該離心或經(jīng)過(guò)0.45um的膜過(guò)濾。
    5.洗脫
洗脫流速應(yīng)根據(jù)情況而定,zui大線性流速約12cm/min(反壓1.5ba),建議流速為1-10cm/h??傮w來(lái)說(shuō),較低的流速,具有較高的分辯率。
    6.再生
凝膠再生通常是先用2-3個(gè)柱體積的洗脫液進(jìn)行清洗,如更換洗脫液,則需要重新平衡。
    7.體積流速與線性流速的關(guān)系
線性流速=體積流速/橫截面積
    8.溶脹體積
由于Sephadex LH-20的溶脹體積依賴(lài)于溶劑,所以對(duì)于不同直徑的柱可根據(jù)比例增加或減少舊柱體積以便計(jì)算出新體積。
新體積=舊體積×(新柱體積/舊柱體積)
    9.膠的性質(zhì)
Sephadex LH-20同時(shí)具備親水和親脂雙重性質(zhì),且被分離物質(zhì)的極性在分離過(guò)程中起著重要作用。
    10.排阻極限 4-5KD(與所用溶劑有關(guān))
    11.上樣量
吸附模式 取決于所需分辯率
分子量大小 小于總體積的20%
正相分配 小于總體積的1%
    12.其他
膠粒形狀 球形,多孔
顆粒大?。ǜ桑?18-111um(直徑)
顆粒大小中間值(干) 70um(直徑)
顆粒大小(甲醇) 27-163 um(直徑)
顆粒大小中間值(甲醇) 103 um(直徑)
zui大線性流速 720cm/min
參考線性流速 60 cm/min
pH的穩(wěn)定性
操作中 2-11
清洗中 2-13
化學(xué)穩(wěn)定性 在許多水溶液及有機(jī)溶劑系統(tǒng)中都穩(wěn)定。在pH2以下或強(qiáng)氧化劑中不穩(wěn)定
高壓滅菌 121℃可忍受20分種
操作溫度 4℃到40℃
保存條件
新填料 4-25℃(干燥)
使用后填料 4-8℃,pH6-8,切勿冷凍,加入抑菌劑(如20%乙醇,0.04%疊氮鈉)
    13.干膠溶脹表
溶劑 床體積(mL凝膠/g干膠粉末)
Dimethyl sulphoxide 二甲亞砜 4.4~4.6
Pyridine 嘧啶 4.2~4.4
Water 水 4.0~4.4
Dimethylformamide 二甲基甲酰胺 3.8~4.2
Saline 生理鹽水 3.9~4.1
Methanol 甲醇 3.8~4.1
Methane dichloride 二氯乙烷 3.8~4.1
Chloroform* 氯仿 3.8~4.1
Propanol 丙醇 3.7~4.0
Ethanol** 乙醇 3.6~3.9
Isobutanol 異丁醇 3.6~3.9
Formamide 甲酰胺 3.6~3.9
Methylene dichloride 二氯甲烷 3.6~3.9
Butanol 丁醇 3.5~3.8
Isopropanol 異丙醇 3.3~3.6
Tetrahydrofuran 四氫呋喃 3.3~3.6
Dioxane 二氧雜環(huán)已烷 3.2~3.5
Acetone 丙酮 2.4~2.6
Acetonitrile*** 乙腈 2.2~2.4
Carbon tetrachloride 四氯化碳 1.8~2.2
Benzene 苯 1.6~2.0
Ethyl acetate 乙酸乙酯 1.6~1.8
Toluene 甲苯 1.5~1.6

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